RT-PCR出一段目的基因，為什么要把它先TA克隆呢？為什么不能直接把它連接到相應(yīng)的質(zhì)粒上呢
RT-PCR出一段目的基因，為什么要把它先TA克隆呢？為什么不能直接把它連接到相應(yīng)的質(zhì)粒上呢
確實可以不一定要TA克隆。你可以在設(shè)計引物的時候在引物的5\’端加上酶切位點，比如你選中XXXYYY位點你可以把引物設(shè)計為AA－XXXYYY－AGCT(AGCT 代表你原來的引物序列）.我一般在頭上加2個A，這樣酶切效果好一些。
兩個引物可以加相同，也可以不同酶切位點。
取決于2點：1。擴增區(qū)沒有該位點，（必須知道你擴增區(qū)的序列）2。對應(yīng)于你的目標(biāo)分子。TA克隆的好處在于選擇靈活，萬一一個位點不好使，同一批質(zhì)粒還可以用其他酶再切。
隨時可以擴增。還有方便下游作業(yè)，比如說你要連接兩端PCR產(chǎn)物，先克隆會比較方便一些。所以2種方法各有優(yōu)缺點，你可以根據(jù)情況選用。
ta克隆的優(yōu)缺點
一、缺點：
1、PCR產(chǎn)物的酶切和判斷比較困難。
2、另外酶切連接過程本身也相當(dāng)?shù)刭M時費力。
二、優(yōu)點：
1、克隆PCR產(chǎn)物較簡便、快捷的方法。
2、不需使用含限制酶序列的引物，不需將 PCR 產(chǎn)物進行優(yōu)化，不需把PCR產(chǎn)物做平端處理，不需在 PCR 擴增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進行克隆。
擴展資料：
T-A克隆由于在PCR過程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：
1、使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。
2、使用不同的Taq酶，在PCR擴增循環(huán)結(jié)束后，加上72℃ 10分鐘一個過程，Taq酶可以在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。
PCR產(chǎn)物怎么做TA克隆
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